| 灵芝对白介素-1（IL-1）产生的影响 |
| 【 整理发布：王力野生灵芝网 】 【 发布日期：7/6/2011 】 浏览次数:1628 |
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文报告日本产灵芝对小鼠腹腔巨噬细胞及大鼠肝脏枯否细胞产生IL-1的影响。用BALB/c小鼠胸腺细胞增殖检测IL-1活力。结果显示：在试管内，灵芝500μg/ml可以促进Lps（10μg/ml）活化的巨噬细胞产生IL-1。口服灵芝整体试验（125、250、500mg/kg）qd.×10同样促进Lps（10μg/ml）活化的巨噬细胞产生IL-1；并与剂量正相关。但无论试管内还是整体，灵芝单独应用对巨噬细胞产生IL-1均有抑制作用。灵芝对枯否细胞产生IL-1未显示明显影响。
关键词 灵芝；白介素-1（IL-1）；巨噬细胞；枯否细胞
灵芝（Ling Zhi, LZ, Ganoderma Lucidum）作为一种传统中药已有2000多年的历史。为进一步探讨灵芝的药理作用机制，本室对日本和汉生药研究所人工培植灵芝的热水浸出物进行了多指标的免疫药理研究。业已证实灵芝对多种免疫功能有调节作用，且在各种病理模型，如Ⅰ、Ⅲ及Ⅳ变态反应、同种异位心肌移植时的排斥现象等显示明显抑制作用。IL-1是调节机体免疫应答的细胞因子之一，还参与某些疾病的病理过程，其重要性日益为人们注意。灵芝对IL-1产生的影响尚未见有报道。本实验就是通过观察灵芝对小鼠腹腔巨噬细胞及大鼠肝脏枯否细胞产生IL-1的影响，为解释其临床作用提供理论依据。
材料与方法
动物
昆明种小鼠，18～22g， ♂； Wistar大鼠，170～250g，♂。BALB/c小鼠，6～7周龄，雌雄兼用，以上动物均由上海医科大学实验动物部提供。
试剂
RPMI-1640培养液，GIBCO产品，含丙酮酸钠1μmol, Hepes 15mmol,小牛血清10%，2-巯基乙醇5×10-5mol。脂多糖（Lipopolysaccharide, Lps)，刀豆蛋白A(Concanavalin A, Con A)，I型胶原酶（Collagenase I），链霉蛋白酶（Pronase E）均为Sigma产品。3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）为中科院上海原子核研究所产品，比活度1110GBq/mmol。
灵芝混悬液：灵芝于0.2%CMC充分研磨后，置80℃水浴振荡4h，用于整体给药。灵芝水溶部分：灵芝溶于生理盐水中，80℃水浴振荡2h，离心1500rpm，10min，收集上清。灵芝冻融部分：灵芝溶于生理盐水，80℃水浴振荡2h，-30℃冷冻1h，迅速融化，反复3次，离心取上清。后两部分溶液均用于离体试验。
腹腔巨噬细胞产生IL-1的诱导
小鼠脱颈椎处死，RPMI-1640培养液冲洗腹腔并收集腹腔巨噬细胞，离心1600rpm，10min，洗2次，计数。以含10%小牛血清的RPMI-1640培养液调细胞浓度至2×106/ml，于24孔培养板中加细胞1ml/孔，37℃，5%CO2培养2h后，洗去非粘附细胞。粘附细胞加或不加Lps（10μg/ml）及灵芝（1～500μg/ml），继续培养24h，离心1600rpm，10min，收集上清，4℃保存，待测。
枯否细胞产生IL-1的诱导
大鼠用戊巴比妥钠麻醉，无菌条件下打开腹腔，门静脉插管（1.5mm）。下腔静脉在肾静脉水平切断，用磷酸生理盐水缓冲液（pH7.2）以40～50ml/min的速度灌流肝脏。灌流液从下腔静脉自然流出，灌流1min冲洗肝内血液。结扎下腔静脉，打开下腔静脉，打开胸腔，经右心房进行上腔静脉插管，形成循环灌流。灌注0.05% I型胶原酶30min，分离肝组织，尼龙网过滤，得全肝细胞悬液，离心500rpm,1min,取上清加链霉蛋白酶（终浓度0.1%），于37℃水浴消化30min,离心3000rpm,5min,洗2次，得非肝细胞悬液，计数后调整细胞浓度为1×106/ml。于24孔培养板贴壁培养20h。去除非贴壁细胞，将贴壁细胞即枯否细胞与Lps或（和）灵芝混合培养24h，收集上清，测定IL-1活性。
IL-1活性的测定
BALB/c小鼠放血处死，取胸腺制备单个细胞悬液并计数。用含20%小牛血清及Con A0.625μg/ml的RPMI-1640培养液调整细胞浓度为107/ml。待测上清以1∶64稀释。于96孔培养板各加100μl细胞悬液，稀释后的待测上清及Lps(10μg/ml),总体积为0.2ml，同时设μCi/孔。用多头细胞收集器收集细胞至醋酸纤维薄膜，液体闪烁计数仪测定每分钟衰变数cpm，以cpm平均值±标准差表示，t检验。
结 果
灵芝在试管内对小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1的影响
灵芝水溶部分可抑制巨噬细胞分泌IL-1，但对Lps诱导IL-1释放无明显影响（表6-1）.
表6-1 灵芝水溶部分在试管内对小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1的影响
灵芝 LPS 3H-TdR掺入量
(μg/ml) (10 μg/ml) (cpm/×106细胞)
-- -- 11163±177
1 -- 10370±400*
10 -- 10354±549
100 -- 6105±400**
500 -- 6597±1123**
-- + 11944±1632
1 + 12215±1194
10 + 10867±1217
100 + 12298±3684
500 + 14832±2143
X±SD; n=3；与对照组比较：*P<0.01, **P<0.01
灵芝冻融部分100～500μg/ml对未经诱导的巨噬细胞分泌IL-1显示抑制作用，而冻融部分500μg/ml对Lps诱导产生的IL-1有促进作用（表6-2）。
表6-2 灵芝冻溶部分在试管内对小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1的影响
灵芝 LPS 3H-TdR掺入量
(μg/ml) (10 μg/ml) (cpm/×106细胞)
-- -- 11163±177
1 -- 12099±946
10 -- 11825±2364
100 -- 6101±1519**
500 -- 6076±262**
-- + 11944±1632
1 + 11550±1263
10 + 12867±222
100 + 9100±642
500 + 15207±1252*
X±SD; n=3；与对照组比较：*P<0.01, **P<0.01
灵芝整体给药对小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1的影响。
灵芝使未经激活的巨噬细胞释放IL-1的活力降低，但对Lps激活的巨噬细胞，灵芝呈协同效应，明显促进IL-1的释放，其作用与药物剂量呈正相关。该结果与试管内实验结果一致（表6-3）。
表6-3 灵芝整体给药对小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1的影响
灵芝 LPS 3H-TdR掺入量
(μg/ml) (10 μg/ml) (cpm/×106细胞)
-- -- 8125±1424
125 -- 4318±366*
250 -- 4277±673*
500 -- 5197±783*
-- + 9565±1262
125 + 10181±1259
250 + 14982±2040*
500 + 17469±3391*
口服qd.×10; X±SD; n=3；与对照组比较：*P<0.05
灵芝在试管内对大鼠肝脏枯否细胞产生IL-1的影响
灵芝水溶部分无论单独作用或与Lps合用，对枯否细胞产生IL-1的活力均无明显影响（表6-4）。
表6-4 灵芝水溶部分在试管内对小鼠肝脏枯否细胞产生IL-1的影响
灵芝 LPS 3H-TdR掺入量
(μg/ml) (10 μg/ml) (cpm/×106细胞)
-- -- 24726±1346
1 -- 28834±4511
10 -- 26889±7606
100 -- 23921±4419
500 -- 21819±4691
-- + 31869±622*
1 + 34299±5980
10 + 29463±6422
100 + 28560±3439
500 + 29755±2489
X±SD; n=4。与无LPS空白组比较：*P<0.05
讨 论
IL-1是单核细胞分泌物具有广泛生物学活性的一种细胞因子，能从多方面调节机体的免疫功能。推理影响IL-1产生或活力的物质也将相应地调节机体的免疫功能。灵芝对IL-1产生起促进作用还是抑制作用与巨噬细胞的状态及灵芝的浓度有关。对静止的巨噬细胞，灵芝抑制其产生IL-1；在刺激原存在的条件下，灵芝呈协同效应，促进IL-1的分泌。
肝脏枯否细胞属于机体单核-吞噬细胞系统。70年代以前由于分离枯否细胞比较困难，人们认为其主要功能是吞噬随血流进入肝脏的异物。随着分离技术的发展，许多研究表明，枯否细胞具有参与机体免疫应答的能力。作者发现在本实验条件下，对枯否细胞产生IL-1，灵芝未显示明显作用。推测枯否细胞属于特殊环境中高度分化的单核-吞噬细胞，其释放细胞因子等免疫调控作用，可能与特有的微环境相关，肝脏局部的一些因素，如肝脏细胞及内皮细胞的分泌物等对其生理效应可能有较大的影响。
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