| 中国灵芝概况及其化学成分 |
| 【 整理发布：王力野生灵芝网 】 【 发布日期：7/6/2011 】 浏览次数:2328 |
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中国的灵芝种类
灵芝属于自然界分布的一类真菌生物。世界上唯独中国古人最早认识、研究、药用和信仰灵芝，并视为仙草和祥瑞之物。
我国大量的古籍、史料记载了灵芝，并反映在医药学、民间文学、宗教信仰、建筑艺术、古典哲学、生物分类及栽培等各个方面。古埃及和古希腊人崇拜蘑菇为“神物”，然而在人类发展史上所占的地位和产生的影响，却远远不及灵芝。从公元前一世纪以来，灵芝经历了数千年的考验，仍不失药用功效，现在又成为科学家多方面研究应用的对象。我国有关灵芝悠久的历史和丰富的种类资源，又成为国内外关注的焦点。
一、古代有关灵芝种类的认识
中国古代对于灵芝的认识起源于《山海经》中关于炎帝幼女“瑶姬”精魂化为“萄草”即灵芝的神话故事。后经加工逐渐演变，更加富于神奇色彩。原来在《礼记·内则》（公元前300年）中记述灵芝“无华而生者日芝木而 ”。在《尔雅翼》（公元前290年）记载“芝，瑞草，一岁三华，无根而生”。说明我国古人把灵芝看作不同于有根、茎、叶的植物。
《淮南子·山训篇》（公元前139年）中说“紫芝生于山，而不能生于盘石之上”。屈原在《楚辞·九歌·山魂》（公元前290年）中讲，“采三秀兮于山间，石磊磊兮葛蔓蔓”。东晋的葛洪在《抱朴子·内篇》（340年）中说“夫芝菌者，自然而生。”这是对灵芝生态习性的描写。古人在认识野生灵芝的基础上又探索培养方法，于是在《仙经》中有“五木种芝，芝生。”东汉王充在《论衡·初禀篇》中便有“紫芝之栽如豆”之说法。
《神农本草经》被认为是我国最早的一部药物学著作，其中详细记载了“六芝”即青芝、赤芝、黄芝、黑芝、紫芝。葛洪在他的《抱朴子》中著录了五种芝草图。尤其这位古代著名医学家、道教人物，又潜心于探索服食芝类长生之法，撰写了有关论著，虽然带有宗教求仙的神秘色彩，但仍然对后世服食灵芝之功效产生了重要的社会影响。他的论著还促进了古代其他菌类的研究和应用。据说仅出自魏晋道教人物之手的芝草类专著估计约百种以上，这在世界菌类史也是罕见的。后来的《唐新修本草》（659年）被认为是我国古代记录“六芝”类真菌重要的药典。
对古籍中六芝的讨论
灵芝从神话中的“瑶姬”化为“萄草”，又经过深化而出现了“六芝”，经历了相当长的时间，在东晋之前古籍中没有“灵芝”之说。“六芝”的出现无疑是古人对芝类认识的发展。吴谱等在《神农本草经》和葛洪的《抱朴子》中主要根据颜色划分“六芝”。葛洪曰“赤者如珊瑚，白者如截脂，黑者如泽漆，青者如翠羽，黄者如紫金。皆光明洞察，如坚冰也”。葛洪又按质地分“五芝，即石芝、木芝、肉芝、菌芝和草芝。”梁代陶弘景在《本草经集注》中也是依据色泽不同论述“六芝”。明代李时珍则进一步从性味和药效功能进行“六芝”分类。
时珍曰“芝类甚多，亦有花实者，本草惟以芝标名，然其种属不可不识。”说明芝类众多，“六芝”只能是对当时知道的灵芝按六类标名，而不是六种。既然如此分类便有其代表种。不过我们今天很难用现代真菌分类学观点对每一类的代表种命以准确的拉丁学名。现在专家对“六芝”认识是一种群体概念，每一种所代表的一个群体。
中国科学院微生物研究所的赵继鼎教授曾多年从事灵芝等多孔菌的分类学研究，他根据《本草纲目》和《别录》中对“六芝”的记载，应用现代已知有关种做了对比分析如下
1.青芝，又名龙芝。他认为云芝（Coriolus versicolor）可能是青芝。此种真菌盖革质，表面有绒毛，色彩变幻，这与《抱朴子》中讲的青芝如翠羽有相似之处，又具有药用价值。
2.赤芝，又名丹芝。认为赤芝便是今天熟悉的灵芝（Ganoderma lucidum）。类似赤芝的还有松杉灵芝（G. tsugae）等。其菌盖表面褐黄色，褐红色，具油漆光泽，又有一个表面光滑的菌柄。
3.黄芝，又名金芝。根据《抱朴子》记载黄者如紫金，大者十余斤，小者三四斤，凡求芝草入名山，必以三月九月。他认为是硫黄多孔菌（Laetiporus sulphureus），此种肉质，黄色，老后变硬而脆。
4.白芝，又名玉芝。根据白色等特点，他认为可能是苦白蹄即药用层孔菌（Fomitopsis offcinalis）。此种形如马蹄，可达数斤，生松等针叶树上，亦可药用。
5.黑芝，又名玄芝。认为黑芝可能是假芝（Amauroderma rugosum）。此种菌盖黑色，新鲜时伤处变血红色，具黑色长柄。认为也可能是黑柄多孔菌（Polyporus melanopus），也是黑盖和黑色长柄。
6.紫芝，又名木芝。认为紫灵芝（中国灵芝）（G. sinense）。此种菌盖褐色，紫黑色至近黑色，菌肉均为褐色至栗褐色，并具长的菌柄。
对于“六芝”赵继鼎先生是按照我国目前已知灵芝科的种和一些不属于本科的多孔菌作了初步考证。如果我们根据“本草”记载并结合当时有关芝类图对比，就会发现上述代表种中像云芝、硫黄多孔菌、苦白蹄、黑柄多孔菌均与有关图不符。仅有赤芝、皱盖假芝、紫灵芝比较接近有关的“六芝”图。
宋代陈仁玉的《菌谱》所示黄芝图与硫黄多孔菌形态比较，后者不属于灵芝类。苦白蹄与白芝、青芝和云芝形态相差甚远，又不是同一科。岩崎园所著《本草图谱》中的青芝图属典型的灵芝形状，白芝和黄芝图也是如此。隋代《太上灵宝芝品〉中所述赤玉芝、青玉芝、龟威芝、生金芝从图所示，其形态均不属于灵芝类，而是蘑菇及其他真菌，有的甚至是具有宗教色彩超自然的图象。所以要想考证清楚“六芝”是比较困难的，有待进一步考究。
灵芝被视为瑞草
中国古人在认识和服食灵芝的过程中，肯定了灵芝的功效。在“本草”中记述“久食轻身不老”，说明灵芝具有扶正固本、促进身体健康的功效。在《汉武内传》中说灵芝是“太上之药”，“得而食之，后天而老”，也说是长生不老。尤其在汉魏时期服食灵芝求延年益寿成了当时社会风尚，灵芝的功效也给人一种神秘感，使古人崇拜、信奉灵芝成其自然。灵芝的形态特征古朴典雅，野生量少，更显得珍贵，古人又将灵芝以迷信色彩描述。把菌盖表面的许多环形轮纹，称做“瑞征”或“庆云”，视为吉祥如意的象征。灵芝成了祥瑞的化身，反映帝王德政和伦理道德的标志。于是上至皇帝，下至庶民把灵芝捧上了祥瑞的宝座。若能获得灵芝便是一件值得庆贺的事。
据说汉武帝元封年间，甘泉宫年久失修，栋梁腐朽而滋生灵芝，大臣便借机歌颂皇帝的功德，说感动天地，使灵芝降生宫廷，祝万事吉祥如意，皇帝万寿无疆，因泰民安，皇帝自然大喜，便降旨于民众每年向朝廷进贡灵芝。
宋代王安石在《芝阁赋》中记述了当朝逼迫民众寻找灵芝的情景。“大臣穷搜远采，山农野老攀援狙木弋 ，以上至不测之所不通，下溪涧壑谷，……人迹之所不通，往往求焉。”说明当时举国上下到处搜寻灵芝瑞草，出现了“四方以芝来告者万数”。据记载宋贞宗（1008）诏令全国进贡芝草，王钦进8193本，又从泰山采芝草3800本送到京城。丁谓向宋贞宗进献芝草9500本，运芝者络绎不绝。要收集如此多的野生灵芝，在交通发达的今天也是极不容易的。
黄庭坚上书朝廷建议废除这种劳民伤财，坑害百姓而进贡灵芝的规定，却无济于事，进贡之事继续到以后。元代永乐宫巨幅壁画《朝元图》则真实地记载了大臣、宫女进贡灵芝的壮观场面。
中国古代将灵芝做为祥瑞之物或由灵芝所代表的一种精神信仰，或者伦理道德的标志，贯穿于中国封建社会，并影响到东邻日本、朝鲜和东南亚地区，后来传至西欧和美洲。在1979年英国出版的《蘑菇百科全书》（The Encyclopedia of Mushrooms）中以巨幅壁版面刊载了选自葛洪《抱朴子》中的一幅图画，反映了一位腰间絮带灵芝瑞草而悠然自得的形象。
灵芝做为中国历史上特有的祥瑞物，影响极为深远和广泛。而今在全国许多古刹寺庙、古建筑、亭台楼阁、古典服饰、传统生活用具，以及出土的大量文物，都能发现有关灵芝和“如意”的形象。佛教自唐朝由印度传及中国后，古人按照当时的心愿，让佛神手持灵芝如意。作者曾在香港中大崇基学院教堂发现一幅刺绣的圣经挂图，其中也绣了两枚形态逼真的灵芝。可能认为这些教派只有融汇了灵芝如意，才会达到完美、理想的精神境界。这可以说是东西方文化交流和相互影响，表现在灵芝方面的典型例证。
古代把灵芝类生物视为吉祥物，与当时缺乏自然科学知识有关，同时与宗教信仰的强大影响也是分不开的。尤其一些造诣不深的方士和本草家过高夸大灵芝的作用，又给灵芝蒙上了阴影，曾出现“黑芝贼”，“白芝丧”等令人厌恶之类的邪说。然而灵芝久经考验，不失其固有的高雅形象和药用功效。特别是近数十年来在医药、保健、种类资源等方面受到国内外科学家的高度重视，再次证明灵芝是中国之一宝，显示出广泛的应用潜力。
灵芝的化学成分
灵芝类所含化学成分复杂，且因所用菌种培养方法、提取方法等不同而异。研究灵芝类的化学成分的目的，在于了解和比较灵芝属不同品种及同一品种的不同发育阶段（如子实体、菌丝体、孢子体）所含的化学成分，通过药理及临床研究确定其有效成分或有效部分。为进一步研究灵芝药理作用机制、提高临床疗效、改进生产工艺及质量控制标准提供理论根据。目前研究较多的灵芝化学成分有：三萜类化合物、多糖类、核苷类、甾醇类、生物碱类、呋喃衍生物、氨基酸多肽类、无机元素、脂肪酸等。
第一节 三萜类化合物
三萜类化合物是灵芝的主要化学成分之一，灵芝中的很多三萜类化合物具有生理活性，如ganoderic acid A. B. C.和D能够抑制小鼠肌肉细胞组胺的释放。ganoderic acid F有很强的抑制血管紧张素酶的活性。赤芝孢子酸A对CCl4和半乳糖胺及丙酸杆菌造成的小鼠转氮酶升高均有降低作用。赤芝孢子内酯A具有降低胆固醇作用。因此对三萜类化合物的进一步深入研究将有利于灵芝有效成分的寻找和进一步阐明其生理活性。
1982年Kubota. T等人首次从赤芝子实体中分离得到三萜类化合物，此后十年来，对三萜类化合物研究最多的是日本，其次是中国（包括台湾）。到目前为止已先后从赤芝子实体和孢子粉中分到了103种新的三萜类化学成分
一、三萜类化合物提取和分离
灵芝中三萜类化合物的提取分离方法可以分为三类，一类是用甲醇或者乙醇提取原料，提取物直接进行层析分离，如H. Konda等用甲醇提取原料，提取物浓缩后悬浮于水，依次用已烷、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯部分经硅胶色谱、高效液相层析（HPLC）分到四个三萜酸。第二类方法是用甲醇、乙醇等提取原料，然后分出总酸部分，进行分离，如Morigiwa等人用70%甲醇提取原料，提取物用1mol/L HCl调pH2~3，再用乙酸乙酯萃取，浓缩后进行分离，分到五个三萜类化合物。Nishitoba等人用乙醇提取原料，提取物浓缩后在水和CHCl3中进行分配，CHCl3层浓缩至一定体积后，用饱和的NaHCO3水溶液萃取，萃取物用6mol/L HCl酸化到pH3~4，水溶液中出现的沉淀以CHCl3溶解，干燥后得总酸提取物，经硅胶柱层析分到五个三萜类化合物。第三类方法是利用制备衍生物的方法进行分离，如KiKuchi等用乙醚提取原料，其酸性部分用重氮甲烷进行甲基化，然后再在硅胶柱上进行分离，从中分到七个三萜酸。Hirotani等用90%MeOH-H2O提取，提取液减压浓缩后加入5%Na2CO3水溶液碱化至pH9，然后用CHCl3萃取，水层用4mol/L H2SO4酸化至pH2，再用CHCl3萃取，CHCl3萃取液用水洗，Na2SO4干燥，浓缩后得总酸部分，该部分再以常规方法用重氮甲烷进行甲酯化，硅胶柱色谱，得到三个新的三萜酸。
灵芝中三萜化合物的分离大多是经过反复硅胶柱层析，较纯的部分薄层、低压柱，高效液相色谱（正反相）制备等方法进行分离纯化。硅胶柱色谱一般常用的展开剂为MeOH-CHCl3，EtAc-C6H6，EtoAc-acetone，EtOAc-CHCl3，CHCl3-MeOH-H2O等系统。HPLC多用乙腈—乙酸铵缓冲溶液以及MeOH-H2O洗脱。薄层检查一般使用的展开剂为CHCl3-MeOH（95∶5，9∶1V/V）或苯—乙酸乙酯（3∶7V/V），香兰醛-硫酸做为薄层斑点的显色剂。
我们曾从赤芝孢子粉酸性脂溶部分中分到七个三萜类化合物，其中五个四环三萜酸，一个四环三萜醇，二个五环三萜内酯化合物，并对它们的结构进行了测定证明有三个新化合物，其余均为首次从赤芝孢子粉中分离出来。下面是三萜类化合物提取分离流程。
二、三萜类化合物的结构测定
（一）三萜类化合物的结构特点
灵芝三萜类化合物分为四环三萜和五环三萜。从灵芝四环三萜类化合物的结构来看，属于高度氧化的羊毛甾烷衍生物。按分子所含碳原子数可分为C30，C27和C24三大类，根据其所含功能团和不同的侧链可有以下六种基本骨架。
在三萜酸的结构中，环上的双键大多位于△8（9）位，在C11位和C23位大部分有羰基，而且在C3、C7、C15位也多被羟基或羰基所取代。在三萜醇、醛和过氧化物的结构中环上大多存在两个不饱和双键，其位置在△7（8），△9（11）位，C11位和C23位也不存在羰基而且环上的取代基明显减少。表6-1列出了迄今为止分到的所有灵芝三萜化合物。目前灵芝三萜化合物的命名有些混乱，同一化合物有不同的名称，对此我们采用最早的命名。
（二）三萜类化合物的光谱特征
1.红外光谱:灵芝中的三萜类化合物大多都有羟基,因而在3300cm-1，1050cm-1有强的羟基吸收峰。三萜酸类化合物在2600～2400cm-1有弱吸收峰，当羧酸被酯化以后这一吸收峰消失。在C15位有羰基的化合物在1740～1760cm-1会出现五元环酮的吸收特征峰。在1720cm-1（酯），1710cm-1（六元环酮），1650cm-1（α、β不饱和酮）也有较强的吸收峰。
2.紫外光谱：由于灵芝中的三萜类化合物大多都有共轭体系存在，因而紫外吸收波长和强度也很有规律，凡在C11位存在羰基的化合物都存在着△8（9）双键，这类化合物的紫外吸收大多在λmax253nm，logε在3.8～4.1之间，而C11位没有羰基的化合物，大多存在着△7（8）、△9（11）共轭双键，因而紫外吸收在λmax237nm，244nm，253nm有三个吸收峰，而吸收强度大多在logε3.7～4.1之间。而在既没有α、β不饱和酮，又没有共轭双键的化合物中，紫外光谱仅表现简单的双键末端吸收在λmax210nm logε4.2左右。
3.质谱：四环三萜化合物质谱裂解的共同特征是失去侧键。羊毛甾烷类的特征裂解是从D环断裂，伴有一个质子的转移，然后经第二次裂解失去侧链和D环的一部分。Kikuchi[11] 在这方面作了很多研究，总结出这类化合物的裂解方式大致如下：
4.核磁共振谱：三萜类化合物的1HNMR中主要信号是双键质子，连氧碳质子和甲基质子（见表6-2）。环内双键质子的δ值一般大于5×10-6，在灵芝三萜化合物中，如ganoderic acid R. S. T. X. Y. Me等的双键位置在△7（8）和△9（11），7位质子的δ值在（5.48～5.86)×10-6之间,11位质子的δ值比7位要处于高场,在δ(5.31～5.39）×10-6之间，侧链上双键的位置可分为二类，一类在△20（22），20位质子的信号在δ（6.04～6.12)×10-6，如ganoderenic acid A.B.C.D等。另一类在△24（25），24位质子的信号在δ（5.4～5.7）×10-6，如ganoderol A和B。
连氧碳质子由于位置、环境和构型的不同，其化学位移变化较大。在C3、C7、C12、C15为羟基取代的化合物中由于羟基构型不同，该碳所连接H的化学位移值和偶合常数也不同，3—H多为α构型，δ值在(3.22～3.31)×10-6，J=10Hz，7—H为α构型时δ：（4.75～4.85)×10-6，J=9Hz，7—H为β构型时，δ：（4.4～4.5)×10-6，J=5Hz。12—H多为α构型，δ：（4.5～4.9)×10-6。15—H多为β构型，δ（4.2～4.90)×10-6。三萜中的甲基信号上有较多的取代基，对甲基的化学位移影响较大。18—CH3通常在δ（0.95～1.0)×10-6之间，当分子中存在△7（8）、△9（11）共轭双键时，该甲基信号向高场位移至δ（0.55～0.60)×10-6，当12位有羟基取代时，该信号出现在δ0.85×10-6左右。21—CH3信号通常出现在δ（0.85～1.0）×10-6之间，为双峰，但当20位有羟基取代时，该信号向低场位移，出现在δ（1.4～1.6）×10-6，当存在△20（22）双键时，该信号出现在δ2.1×10-6，且都为单峰。27—CH3通常出现在δ（1.1～1.2）×10-6，当存在△24（25）双键时，该甲基信号在δ1.6×10-6左右。32—CH3受7位和15位取代基的影响较大。当7位和15位同时被羰基取代时，该号在δ（1.6～1.8）×10-6之间，当7位和15位均为羟基或一个羟基一个羰基时则无明显变化均出现在δ（1.2～1.3）×10-6之间，当7位和15位无取代基时，该甲基信号则出现在δ0.88×10-6左右。30—CH3和31—CH3受3位取代基影响较大，当3位是羟基时30—CH3在δ1.0×10-6左右，31—CH3在δ0.85×10-6左右。当3位是羰基时，17—H在δ1.8×10-6左右，而当15位是羰基时17—H向低场移至δ2.2×10-6左右。从17—H的位置可以判断C15位所连接的基团。
13CNMR的运用使得化合物基本骨架的确定日趋准确。三萜化合物的碳谱中最容易分辨的信号来自双键碳原子和连氧碳原子。前面提过灵芝三萜母核上的双键位置有两类，在△8（9）这类化合物中，C8在δ（151～160）×10-6，C9在δ（140～146）×10-6，在△7（8）和△9（11）这类化合物中C7在δ（120～121）×10-6，C8在δ（140～142）×10-6，C9在δ（141～145）×10-6，C11在δ（115～117）×10-6。侧链上的双键位置也有两类，一类是△20（22），C20在δ（154～157）×10-6，C22在δ（124.3～124.7）×10-6；另一类是△24（25），C24在δ（139～145）×10-6，C25在δ（126～129）×10-6。当下列各碳连有羟基时，它们的化学位移值分别为C3δ（77～79）×10-6，C7δ（66～68）×10-6，C12δ（77～79）×10-6，C15δ（72～74）×10-6。当下列各碳连有羰基时，它们的化学位移值分别为C3δ（215～216）×10-6，C7δ（198～200）×10-6，C15δ（205～217）×10-6，C23δ（207～208）×10-6。羧酸酯的化学位移在δ（170～178）×10-6。C3、C7、C15取代基不同时，C1在δ（35～37）×10-6，C2在δ（34.1～34.8）×10-6，C4在δ（46～47）×10-6，当C3连接的是羟基时，这三个碳的信号均向高场位移，C1在δ34×10-6，C2δ27×10-6，C4δ38×10-6左右。C7是羰基取代时C6在δ（33～37）×10-6，C7是羟基取代时C6在δ（26～28）×10-6。C15是羰基时C14在δ（57～59）×10-6，C15是羟基时，C14在δ（52～53）×10-6。
近年来发展起来的1H—1H和1H—13C COSY等二维核磁共振谱已应用在灵芝三萜结构的测定中。
5.旋光光谱：旋光光谱主要是解决绝对构型问题，从文献报道的CD谱数据总结出CD谱与绝对构型关系；凡是具有[I]式绝对构型者，C7为羟基，不管3位或15位是羟基或羰基取代，CD谱都呈现下列Cotton效应，（290～295）nm（—），（248～257）nm（+），（207～217）nm（—）；凡是在[I]式结构中C7为酮基者，则不管3位或15位的取代基如何，都呈现如下Cotton效应：（305～307）nm（—），（272～278）nm（+），（253～256）nm（—），（225～231）nm（+）。
Nishitoba等人在鉴定epoxyganoderiol A的绝对构型时，应用CD谱确定了C24和C25的绝对构型。在epoxyganoderiol A的侧链上存在着一个环氧基团，为了确定24和25位是S还是R，首先以羊毛甾醇为原料，经反应得到S和R两种构型的化合物，反应如下：
a)AC2O/pyridine, b) SeO2/dioxane, c) NaBH4/CeCl3·7H2O/MeOH-THF
d)(+)-DETor (-) -DET/Ti (O1Pr) 4/TBHP/CH2Cl2
分别将7b和7a溶于CCl4溶液中，加入Eu（fod）3络合物，测其旋光谱，得到如下结果：
以上两个化合物的CD谱的Cotton效应是与C25的Newman投影相一致的。正Cotton效应为25S负Cotton效应为25R。在相同条件下测epoxyganoderiol A的CD谱，显示313nm（△ε+10.9）为正Cotton效应，证明25位的绝对构型为S，通过测定NOE，证实24位绝对构型为S。
（三）结构测定中的化学反应
随着仪器分析新技术、新方法的发展，各类谱学方法和X射线—衍射等分析手段已在结构测定中得到了广泛的应用。经典的化学方法与仪器分析相结合，使三萜化合物的结构测定快速而准确并达到了微量的水平。化学反应常用于证实分子骨架中取代基类型、数目、位置及构型等。
1.氧化反应 氧化反应主要用来确定分子中所含羟基、羰基或酰基的数目和位置等。应用较多的是将羟基氧化成羰基，比较常用的是铬酐—吡啶的方法，也有将铬酐溶于AcOH中搅拌加入样品中，室温下搅拌2h，用水稀释，氯仿提取，提取液经水洗干燥浓缩后经薄层制备而得到氧化产物。
2.酰化反应 酰化反应对于确定分子中羟基的数目、性质、构型很有帮助，常用的乙酰化反应，通常采用醋酐—吡啶室温处理的方法。
3.水解 由于部分灵芝三萜酸中带有乙酰基，为确定乙酰基的存在和数目，采用了水解的方法，如Komoda将ganoderic acid F溶于甲醇，用5%Na2CO3室温处理3h后，用2mol/L HCl酸化，除去甲醇后用CHCl3萃取，水洗CHCl3液后Na2SO4干燥，蒸干。通过TLC制备得水解产物。
4.还原 还原反应主要用来确定分子中有无不饱和双键及羟基、羰基、取代基的位置。如Nishitoba等人在确定lucidenato G结构时，为了证实C26位上存在着羟基，先将lucidenate G甲基化，然后再用NaBH4进行还原，得到其丙酮化物，从而证实了C26位存在着一个羟基。
第二节 多糖类化合物
多糖类化合物是灵芝所含化学成分之一，现已证明，灵芝多糖类具有抗肿瘤作用、免疫调节作用、降血糖作用、降血脂作用、抗氧化作用和抗衰老作用，故灵芝多糖类是灵芝的主要有效成分。临床试验也证实，灵芝多糖可作为肿瘤化学治疗和放射治疗的有效辅助治疗药。有关灵芝多糖类的分离、纯化、结构确证的研究方兴未艾，迄今仍为国内外瞩目的重要课题。
一、灵芝多糖类的分离、纯化及鉴定
灵芝多糖类的分离、纯化及结构确证的方法及步骤可概括如下：多采用热水提取、分部沉淀的方式分离灵芝的多糖组分；进一步经各种层析如DEAE纤维素柱色谱、Sephadex G75柱色谱，凝胶过滤如Sepharose CL—4B凝胶过滤，高压电泳和聚丙酰胺凝胶电泳等处理可获纯化的多糖；后者经酸水解、纸色谱、气相色谱分析可确定其单糖组分，经酶水解可检测殊碳糖（anomeric）结构；经甲基化技术及Smith降解、气相色谱、气质联用、紫外及红外光谱分析、核磁共振等可确定多糖的连接方式和基本化学结构。多糖的分子量可通过凝胶柱色谱如SephadeaxG—100柱色谱、超离心测沉降系数等方法测定，一般在测得分子量范围后，求出平均分子量。
二、灵芝多糖类的理化特性
由于灵芝的种类、产地、分离提取方法各异，所获灵芝多糖的理化特性、分子量、单糖组分和连接方式不同，生物活性亦有差异。如Hiroshi等（1985）报道，赤芝子实体热水提取物经浓缩、透析及系列色谱后获得两种多糖ganoderan A和B。ganoderan A的分子量9 300，旋光度[α]D+58.8°，ganoderan B分子量3 600，旋光度[α]+33.3°，二者对小鼠均具降血糖作用。随后，他们又从赤芝子实体中分离出两个降血糖有效成分ganoderan B和C，均为糖肽，分子量分别为7 400和5 800。物理化学和化学研究证明，ganoderan B含吡喃葡萄糖酰基β-1→3主链和β-1→6侧链，ganoderan C则含D-吡喃葡萄糖酰基β-1→3和β-1→6连接和D-吡喃半乳糖酰基α-1→6连接。Mizuno等（1986）报告，赤芝子实体经85%乙醇（80℃），热水（100℃），3%草酸铵（100℃）和5%氢氧化钠（30℃）提取后，残渣再用5%氢氧化钠（含0.1%硼氢化钠，80℃），20%氢氧化钠（含0.1%硼氢化钠，30℃）和5%氯化锂（溶于二甲醋酸铵中，70℃）提取，获多糖组分A、B、C。A和B经乙醇分离，醋酸沉淀，Sepharose CL-4B凝胶过滤，得4个β-葡聚糖，其中I和II来自A，III和IV来自B。从C分离出脱乙酰壳多糖（chitosan）（V）。I—V经80%甲酸（85℃）处理可获相应的甲酰化多糖和低分子量多糖。I—IV主要由葡萄糖和少量的糖醛酸、木糖、甘露糖组成，并具β-（1→3）-D-葡聚糖主链和β-（1→6）葡萄糖基侧链，其分子量分别为330 000、60 000、160 000和110 000。不同之处是IV不含木糖，但含1.2%蛋白质。V经酸水解后，主要含葡萄糖胺，并含少量葡萄糖，经红外光谱和X射线分析证明为脱乙酰壳多糖。给小鼠腹腔注射II、III以及III的甲酸酯和I～IV的低分子量多糖均具有宿主中介性的抗肿瘤活性，半数抑瘤量（ID50）分别为42.5mg/kg、34.1mg/kg、70.2mg/kg、22.4mg/kg、17.0mg/kg、32.1mg/kg和25.8mg/kg。Mizuno等（1985）报告，赤芝子实体经水提取后，其残渣经3%草酸铵溶液（100℃）和5%氢氧化钠溶液（30℃）提取后，得2个水不溶多糖A和B。A经真空浓缩、透析、冻干，Shepharose CL-48凝胶过滤，获主要组分C。B用醋酸中和至pH5～6，得酸性异多糖D，加乙醇沉淀得糖蛋白E和另一种异多糖。C由酸性β-D-葡聚糖构成，含葡萄糖77%、葡萄糖醛酸10.3%以及少量的果糖、木糖、甘露糖和半乳糖，分子量10 000～30 000。D的分离程序同A，它含两个主要成分G和H，G和H均为酸性异多糖，分别含葡萄糖92%和95%，葡糖醛酸9.7%和13.0%以及少量果糖、木糖、甘露糖、乳糖，分子量70 000～100 000。给小鼠腹腔注射A—H对S180均具有抗肿瘤活性，50%抑瘤量为（6.3～26.3)mg/kg，但口服无效。1989～1994李荣芷、何云庆等先后报告，赤芝子实体经热水提取，乙醇分部沉淀、透析、除蛋白等步骤得灵芝多糖BN3A、BN3B、BN3C和GL-A、GL-B、GL-C。进一步经DEAE纤维素柱色谱分离，酶解，酸水解，过碘酸氧化，甲酸生成，Smith降解、气相色谱、高压液相色谱分析和光谱分析等从BN3B、BN3C、GL-A、GL-B和GL-C共分离鉴定了18个灵芝多糖均一体，其中5个肽多糖、4个葡聚糖，其余为杂多糖，其化学结构及分子量见表6-4。
表6-4 灵芝多糖的化学结构和分子量
均一体
化学结构
分子量
BN3B
BN3B1
β（1→6）β（1→3）
葡聚糖
3.50×104
BN3B2
β（1→6）β（1→3）
阿拉伯半乳聚糖
4.00×104
BN3C
BN3C1
β（1→6）β（1→3）
葡聚糖
1.62×104
BN3C2
β（1→6）β（1→3）
肽多糖
2.45×104
GLA
GLA2
肽多糖
0.93×104
GLA4
均以β（1→3）为主
杂多糖
1.33×104
GLA6
含少量β（1→6）及β（1→4）
肽多糖
1.28×104
GLA7
以半乳糖、葡萄糖为主
杂多糖
1.20×104
GLA8
肽多糖
1.48×104
GLB
GLB2
β（1→4）为主，尚有β（1→6）
葡聚糖
0.71×104
GLB3
β（1→4）为主，极少β（1→6）
甘露葡聚糖
0.77×104
GLB4
β（1→4）
杂多糖
0.90×104
GLB6
β（1→4）含乙酰基
杂多糖
0.88×104
GLB7
β（1→4）为主，尚有β（1→6）
杂多糖
0.90×104
GLB9
β（1→4）为主
半乳葡聚糖
0.93×104
GLB10
β（1→4）β（1→6）含乙酰基
杂多糖
0.68×104
GLC
GLC1
β（1→4）少量β（1→6）
肽多糖
0.57×104
GLC2
β（1→4）少量β（1→6）含乙酰基
葡聚糖
0.60×104
Mizuno等（1982）经热水提取，乙醇分部沉淀，并经离子交换色谱，pH依赖的Cetavlon处理、凝胶过滤以及Con A-Sepharose GL-4B亲和色谱等纯化，从人工培养的平盖灵芝菌丝体中得到一个多糖组分。进一步通过甲基化、核磁共振、过碘酸氧化、Smith降解和β-D-葡聚糖酶（β-D-glucanase）分解等技术研究多糖的化学结构。α-葡聚糖组分具有α（1→4）葡萄糖苷主链，主链上每9～12个残基连接α（1→6）支链，该组分仅有微弱抗肿瘤活性。β-葡聚糖组分具有β（1→3）葡萄糖苷主链，主链上每12个残基通过β（1→6）连接一个单糖苷支链。其中之一显示显著的抗小鼠S180活性，50%抑瘤剂量为0.74mg/kg。
Mizuno和Miyasaki等分别从赤芝、平盖灵芝和紫芝加哥提取出具有抗肿瘤活性的多糖。并确证其基本化学结构。
就抗肿瘤活性而言，灵芝多糖并无种间差异，它们和从其他真菌中所获多糖一样，具有以下三个特性：
1.初级结构的分子量在3×105以上。
2.多聚物的连接方式均有β-1-3-D-残基的主链和β-1-6-D-葡萄糖侧链残基。但从不同真菌提取的多糖的β-1-6-D-葡萄糖的分支程度不等，灵芝多糖的主链残基与侧链残基的比例为5∶2，即每个主链残基环绕2个β-1-6-D-葡萄糖残基。无1-6β侧链的1-3-β葡聚糖未见抗肿瘤活性。
3.多糖的三维螺旋结构参与其抗肿瘤活性，此结构遭破坏则影响其活性。
第三节 灵芝的其他化学成分
灵芝除了含有多糖和三萜类化学成分以外，还含有核苷类、甾醇类、生物碱类、氨基酸多肽类和呋喃衍生物等化学成分。
一、核苷类
核苷类是具有广泛生理活性的一类水溶性成分，余竞光等从薄盖灵芝菌丝体中分离得到五种核苷类化学成分，其中灵芝嘌呤是新化合物。Shimiz等人从赤芝子实体中也得到四种核苷类化合物。灵芝中核苷类化合物的提取方法一般是将灵芝菌丝体乙醇提取物浓缩后溶于水，依次以乙醚、乙酸乙酯萃取，萃 取后的水溶液通过阳离子树脂处理，流出的溶液及水洗液通过大孔树脂色谱，得到尿嘧啶核苷、尿嘧啶。交换后的阳离子树脂用NH4OH处理，依次用乙醇、水洗脱。95%乙醇洗脱部分经硅胶柱色谱及制备薄层色谱得到腺嘌呤、腺嘌呤核苷和灵芝嘌呤等。这几种核苷类的结构如下：
由赤芝孢子粉和薄盖灵芝菌丝体制成的增肌注射液在临床上广泛应用于进行性肌营养不良，萎缩性肌强直等疾病的治疗，并有较好的疗效。动物实验证明尿嘧啶和尿嘧啶核苷对实验性肌强直症小鼠血清醛缩酶有降低作用。SHimizu等人发现腺嘌呤核苷有很强的抑制血小板凝集血小板凝聚的作用和镇静、抗缺氧及促进心肌组织摄取86Rb的作用。
二、甾醇类
灵芝中甾醇含量比较高，仅麦角甾醇含量就达千分之三左右。已知从灵芝中分到的甾醇有近二十种，其骨架分为麦角甾醇类和胆甾醇类两种类型，甾醇类化合物有麦角甾醇（ergosterol），麦角甾醇棕榈酸酯（ergosta-palmitate）；麦角甾-7，22-二烯-3-酮（ergosta-7,22-dien-3-one）；羊毛甾-7，9（11），24-三烯-3β，21-二醇（lanosta-7,9(11),24-trien-3β,21-diol）；麦角甾-7，22-二烯-3β-醇（ergosta-7,22-dien-3β-ol）；5α-豆甾烷-3.6-二酮（5α-stigrmastan-3.6-dione）；β-谷甾醇（β-sitosterol）；24-甲基胆甾-7-烯-3β-醇[（24s）-24-methyl-5α-cholest-7-en-3β-ol]；麦角甾4.6,8(14),22-四烯-3酮（ergos-ta-4,6,8(14),22-tetra-en-3-one）;24(s)-24—甲基5α-胆甾-7，16-二烯-3β-醇，[(24s)-24-methyl-5α-cholest-7,16-dien-3β-ol]；异麦角甾酮（iso-ergosteion)；以及麦角甾醇过氧化物（ergosterol peroxide),ergosta-7,22-dien-3β-yl linoleate,5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-yl lionleate,ergosta-7,22-dien-2β,3α,9α-triol等。
甾醇类化合物的提取分离多以乙醇提取原料，然后用乙醚萃取，再用NaHCO3水溶液萃取乙醚溶液，除去酸性部分，然后用硅胶柱层析分离甾醇类化合物，甾醇类化合物的生理活性报道很少。
三、生物碱类
灵芝中的生物碱含量比较低，仅从野生灵芝、赤芝孢子粉、薄盖灵芝中分到过生物碱，有胆碱（choline）；甜菜碱（betains）及其盐酸盐γ-三甲胺基丁酸（γ-butyrobetaine），灵芝碱甲（ganoine,I），灵芝碱乙（ganodine,II）。
灵芝生物碱的分离一般是用乙醇和水相继提取，提取物经乙醚脱脂，水溶部分采用雷氏盐沉淀法或树脂法得到含氮部分，再经薄层色谱和制备薄层色谱得到单体生物碱。
灵芝中生物碱虽然含量较低，但有些具有一定的生物活性，γ-三甲胺基丁酸在窒息性缺氧模型中有提高存活时间的作用，以及能使离体豚鼠心脏冠脉流量增加。甜菜碱临床上将其和N-脒基甘氨酸（glycocyamine）共用以治疗肌无力[18]。
四、呋喃衍生物
灵芝中的呋喃衍生物类是从发酵的薄盖灵芝菌丝体乙醇提取物乙酸乙酯溶解部分经硅胶柱色谱得到的，有以下几种化合物，并未见生理活性的报道。
1.R=CH2OH(5-羟甲基呋喃甲醛) 1,1′=α-糠醛基二甲醚
2.R=CH2OCOCH3(5-乙酰氧甲基呋喃甲醛)
3.R=CH2OC4H9(5-丁氧甲基呋喃甲醛)
五、氨基酸多肽类
灵芝中的氨基酸有天门冬氮酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、γ-丁基氨酸等，并发现有含硫氨基酸，其结构经X-衍射分析确定为硫组氨酸甲基内铵盐。其结构如下：
实验证明天门冬氨酸、谷氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丙氨酸等可以提高小鼠窒息性缺氧的存活时间。
从灵芝中还分到多肽类化合物，其中有两种中性多肽，一种水解后鉴定含有亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脯氨到、丙氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、甘氨酸等八种氨基酸；另一种多肽可使小鼠窒息性缺氧的存活时间由21min50s提高到45min47s。水解后鉴定含有苯丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天门冬氨酸等。分离到的酸性多肽经水解得到十一种氨基酸，碱性多肽经水解得到四种氨基酸，初步确定氨基酸排列次序是鸟氨酸—甘氨酸—脯氨酸—脯四肽。
氨基酸的分离采用色谱、电泳双向色谱等方法，与已知品对照，茚三酮显色，进行鉴定，近年来仪器的发展使得氨基酸分析更现代化，用氨基酸分析仪即可得到各种氨基酸的数量和含量。肽的鉴别是靠高压电泳及双向色谱方法。
六、无机元素
灵芝中含有多种微量元素，有Mn，mg，Ca，Cu，Ce，Sr，Ba，Zn，Fe，P，B，Cr，Ni，V，Ti等，灵芝的锗（Ge）含量与一般植物相似，但它对锗的富集能力比较强，很多研究者将无机锗加入灵芝培养基（液）中以得到较高含量的有机锗。锗并非灵芝的主要有效成分。
七、其他
从灵芝中还得到一些脂肪酸、长链烷烃等，有苯甲酸、硬脂酸、棕榈酸、十九烷酸、廿二烷酸、廿四烷酸、卅一烷、廿四烷，还有甘露醇、海藻糖、烟酸等。
关于灵芝及其制剂的质量控制问题。
灵芝及其制剂在临床上应用比较多，其质量控制问题一直是许多生产厂家和科研工作者研究的课题，但在这方面的报道并不多，根据我们多年对灵芝的研究的经验，认为应以多糖和三萜的含量做为栽培和野生灵芝的质量控制标准，这是因为灵芝含有较多的多糖，而且这些多糖大多具有提高免疫功能的作用，这与灵芝滋补强壮、扶正固本的作用是一致的。灵芝中含量比较高的另一类成分是三萜，而且一些三萜化合物已在几个方面表现比较强的生理活性，因此三萜含量的测定可以作为灵芝的质量控制标准之一。
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