| 灵芝对巨噬细胞产生肿瘤坏死因子（TNF）的影响 |
| 【 整理发布：王力野生灵芝网 】 【 发布日期：7/6/2011 】 浏览次数:2057 |
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提要 灵芝1～100μg/ml对L92细胞的生长无直接影响。在加灵芝与不加灵芝的条件下观察重组肿瘤坏死因子（γTNF）对L929细胞的杀伤作用证明灵芝不影响γTNF的杀伤肿瘤细胞活性。但灵芝0.01～100μg/ml在试管内促进小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF。巨噬细胞在试管内经灵芝预培养8h后，洗去药物再加LPS，发现灵芝对细胞的预处理可以增加巨噬细胞在LPS诱导下TNF的产生。此外，整体研究证明口服灵芝100～300mg/kg qd×14可以增高由BCG启动及内毒素诱导的小鼠血清中TNF水平。
灵芝 肿瘤坏死因子
1975年Carswell等报道接种卡介苗(BCG)后又注射内毒素的小鼠血清可使多种小鼠肿瘤因出血坏死而消退,但并不影响正常细胞[1].现在知道此乃由肿瘤坏死因子(TNF)介导,并证明TNF是由单核细胞系产生的一种蛋白质,能导致多种动物肿瘤出血与坏死,并在试管内对培养的肿瘤细胞具有直接杀伤作用。近年利用遗传工程制备了重组的TNF，对TNF的研究愈益深入，证明其有广泛的生物学活性，对纤维母细胞有致分裂作用，能激活粒细胞功能，刺激细胞因子的产生，并能调节T细胞功能。这些结果说明TNF是一种能介导机体多种免疫与炎症过程的重要细胞因子[2～3]。
灵芝（Ling Zhi, LZ, Ganoderma Lucidum, Fr. Karst）长期用作保健药品。上海医科大学药学院药理教研室在前阶段工作中已报道灵芝能调节多种免疫功能。包括刺激巨噬细胞吞噬，提高网状内皮系统功能，促进碳粒廓清，增加Lps诱导的IL-1产生，以及抑制抗体形成细胞及迟发型变态反应等。为进一步了解灵芝的免疫药理作用，本文重点研究灵芝对巨噬细胞产生TNF的影响。
材料与方法
动物
C57BL/6小鼠，♂，8～10周龄；昆明种小鼠，♂，20～24g。均由上海医科大学实验动物部供应。
细胞株
小鼠纤维母细胞瘤L929细胞株由上海第二军医大学药学院钱定华教授惠赠，于含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中传代培养。
试剂
灵芝由日本和汉生药研究所制备热水提取物，按前文方法配制。脂多糖（Lps）为Sigma产品。γTNF由钱定华教授惠赠。卡介苗及硫乙醇酸钠培养基由卫生部上海生物制品研究所供应。内毒素由第二军医大学微生物教研室制备。结晶紫为上海崇明试剂厂产品。RPMI-1640为GIBCO产品，按前文方法配制。
在试管内诱导TNF产生
小鼠腹腔注射5%硫乙醇酸钠2ml后4d取腹腔细胞，调节细胞浓度至2.5×106/ml，加入24孔培养板，每孔1ml。37℃ 5% CO2中培养2h，洗去上浮细胞。各孔加或不加脂多糖和不同浓度灵芝，继续培养24h，收获不含细胞含TNF的上清液，置-30℃，待测。
整体TNF之产生
昆明种小鼠静脉注射BCG 0.02% 0.2ml，随机分成4组：对照组口服0.5% CMC 0.5ml qd.×14；其余三组分别口服灵芝100，200，300mg/kg qd.×14。两周后每鼠静脉注射25μg内毒素，90min后眼眶静脉窦取血，分离血清，置-30℃，临用前适当稀释。
TNF测定
因为L929细胞对于TNF的杀伤作用很敏感，为此TNF活力的测定采用结晶紫染色经TNF处理的L929表示[4]。以每ml含5×105个细胞（活力>95%）接种于96孔培养板上，每孔100μl，37℃ 5% CO2中培养20h。每个实验条件复孔3只。培养终止后取出培养板快速倾出培养液，加入100μl经适当稀释的待测样品及100μl含放线菌素-D的RPMI-1640，使最终浓度为1μg/ml，继续培养20h，移去上清，培养板于0.5%结晶紫中染色20min，淋洗，板自然干燥，以酶标仪于590nm处测OD值。
细胞毒%（Oytotoxicity %）计算公式如下
ODtest
ODtest
细胞毒%= ×100%
ODcon
OD为未被杀伤L929细胞结晶紫染色后于590nm的吸收度，OD值越大，细胞杀伤越小。
ODcon——对照孔，即无TNF孔的OD值
ODtest——加入各种稀释度TNF样品的OD值
TNF单位U/ml——样品杀伤50%靶细胞时的稀释倍数
结 果
灵芝对L929细胞生长的影响
如表8-1所示，在试管内，灵芝1～100μg/ml对L929细胞的生长无直接影响。
表8-1 灵芝对L929活性影响
药物 剂量μg/ml OD
对照 -- 0.380±0.02
灵芝 1 0.357±0.015
灵芝 10 0.370±0.036
灵芝 100 0.363±0.021
二、 灵芝对γTNF杀伤肿瘤细胞作用的影响
表8-2证明5U γTNF可产生76.3%的细胞毒作用，加入灵芝1～100μg/ml并不影响5U γTNF的作用。
表8-2 灵芝对γTNF作用的影响
药物 μg/ml γ-TNF（U） 细胞毒%
对照 -- 5 76.3±1.3
灵芝 1 5 75.6±0
灵芝 10 5 74.8±3.4
灵芝 100 5 77.0±5.6
三、灵芝在试管内刺激巨噬细胞产生TNF
表8-3、8-4表明，灵芝0.02～1μg/ml在试管内刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF，其效应与灵芝浓度呈正相关，但高浓度灵芝100μg/ml时则转向抑制。这说明灵芝对TNF的产生亦呈双向反应，低浓度刺激，高浓度产生抑制效应。并证明未经抽滤的灵芝在试管内的作用较经抽滤的灵芝为强。
表8-3 灵芝（未抽滤）对TNF产生的影响
OD TNF产量
组别 μg/ml 上清稀释 （U/ml）
1∶40 1∶80 1∶160
对照 -- 0.137±0.015 0.210±0.01 0.260±0.01 63.4±2.1
灵芝 0.01 0.150±0 0.170±0.01* 0.210±0.017* 89.9±6.1**
灵芝 0.1 0.133±0.006 0.177±0.006* 0.220±0.01* 86.7±4.0**
灵芝 1 0.120±0 0.180±0.02 0.200±0.026* 103.8±5.3**
灵芝 10 0.143±0.025 0.173±0.015 0.207±0.012** 93.9±6.0**
灵芝 100 0.147±0.006 0.207±0.015 0.247±0.015 61.8±2.5
对照孔OD值：0.363±0.006; X±SD; n=3; 与对照组比*P<0.05, **P<0.01
表8-4 灵芝（抽滤）对TNF产生的影响
OD TNF产量
组别 μg/mg 上清稀释 （U/ml）
1∶40 1∶80 1∶160 1∶320
对照 -- 0.347±0.025 0.420±0.053 0.473±0.015 0.493±0.07 64.8±6.8
灵芝 0.01 0.330±0.017 0.473±0.047 0.540±0.062 0.623±0.03 55.2±3.1
灵芝 0.1 0.323±0.015 0.463±0.02 0.502±0.02 0.590±0.053 60.3±3.8
灵芝 1 0.263±0.012* 0.420±0.035 0.493±0.025 0.603±0.05 81.7±3.9*
灵芝 10 0.283±0.024* 0.390±0.035 0.517±0.04 0.610±0.06 79.4±3.8*
灵芝 100 0.350±0.01 0.507±0.04 0.650±0.017 48.4±1.7*
对照孔OD值：0.787±0.015; X±SD; n=3; 与对照组比较：*P<0.05
四、灵芝预处理巨噬细胞对后者诱导产生TNF的作用
观察巨噬细胞经灵芝预培养后诱导产生TNF的情况。巨噬细胞（2.5×106/ml）与含灵芝0.01～100μg/ml或不含灵芝对照组培养8h后，倾去上清，细胞洗2次，加入Lps 10μg/ml，37℃ 5% CO2中培养24h。测定上清TNF活力。结果表明灵芝预处理可使巨噬细胞产生TNF略有增加（表8-5）。
表8-5 灵芝预培养对TNF释放的影响
组别 剂量 μg/ml TNF细胞毒 %
对照 -- 45.6±2.5
灵芝 0.01 57.5±5.9*
灵芝 0.1 47.8±2.5
灵芝 1 57.2±2.5**
灵芝 10 53.9±1.9*
灵芝 100 51.1±3.8*
五、整体研究灵芝对TNF产生的影响
表8-6表明口服灵芝100，200，300mg/kg qd.×14可使BCG启动内毒素诱导的小鼠血清TNF水平明显上升。
表8-6 灵芝在整体对TNF产生的影响
组别 剂量 mg/kg TNF 细胞毒 %
对照 -- 2.90±1.2
灵芝 100 50.0±7.5**
灵芝 200 40.0±9.9**
灵芝 300 26.5±8.9*
讨 论
自TNF受到广泛注意以来，有些学者建立了多种简单而又敏感的试管内测定TNF活性的方法，如3H-TdR释放法，中性红染色法及结晶紫染色法等。Flick等曾比较上述方法[4]，认为以放线菌素-D处理靶细胞L929，再以结晶紫染色活细胞的方法最敏感。本室建立此方法且探索了L929细胞最佳密度，放线菌素-D的合适浓度及启动用硫乙醇酸钠的剂量等。研究证明所用方法比较敏感且可重复，加入放线菌素-D使测定更敏感，培养时间缩短。
本研究证明灵芝在试管内可以促进巨噬细胞产生TNF。灵芝本身对靶细胞L929并无直接杀伤作用。同时证明灵芝在试管内与γTNF无明显协同作用。试管内实验发现未经抽滤的灵芝溶液其作用较经抽滤的灵芝为强。同时证明灵芝0.01～1μg/ml促进巨噬细胞产生TNF，在高浓度100μg/ml时则转为抑制，这与作者通过以往研究认为灵芝是一个免疫调节剂的观点一致。
整体研究亦证明口服灵芝100～300mg/kg qd.×14可使经BCG启动内毒素诱导的小鼠血清TNF水平上升。此结果与作者过去报道灵芝促进巨噬细胞吞噬，加速碳粒廓清，提高网状内皮系统功能的结论一致。上述结果说明灵芝可以通过间接的方式提高机体防御机制，从而发挥抗肿瘤与抗感染的作用。
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