| 灵芝护肝作用的实验研究 |
| 【 整理发布：王力野生灵芝网 】 【 发布日期：7/6/2011 】 浏览次数:2506 |
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灵芝的热水提取物250或500mg/kg口服可以明显降低因D-氨基半乳糖和内毒素合用导致中毒的小鼠血清谷丙转氨酶的活力升高。灵芝在试管内能减少大鼠原代培养肝细胞受四氨化碳中毒时释放的乳酸脱氢酶及谷丙转氨酶。灵芝也降低口服四氯化碳导致肝中毒的小鼠血清谷丙转氨酶活力。由此证明灵芝对于受损的动物肝脏有一定的保护作用。
关键词 灵芝；动物肝损伤；谷丙转氨酶
灵芝是高等真菌Ganoderma Lucidum, Fr. Karst的子实体，在中国传统用作补药及镇静药。根据《本草纲目》记载，灵芝能补五脏之气。本文研究灵芝的热水提取物对肝脏损伤动物病理模型的作用。
1967年发现D-氨基半乳糖可引起大鼠肝脏受损并称其病理变化与人类肝炎病变有一定相似性。但动物对D-氨基半乳糖的敏感性存在较大的种属与个体差异，小鼠远不及大鼠敏感。有报道内毒素可以增加D-氨基半乳糖的毒性[1]。本实验着重研究D-氨基半乳糖及内毒素对小鼠肝脏的损害作用，并观察灵芝对此损害的影响。此外，四氯化碳是一种经典的肝毒剂，本研究分离大鼠肝细胞观察四氯化碳对原代培养肝细胞的损害，并整体引致小鼠中毒，观察灵芝对该中毒的影响。
材料与方法
动物
昆明种小鼠，21～26g;Sprague Danley(SD)种大鼠，180～220g。♂♀兼用。均由上海医科大学实验动物部供应。
试剂
灵芝热水提取物由日本和汉生药研究所提供，为棕黄色粉末。取一定量灵芝提取物溶于0.2%羧甲基纤维素钠（CMC），作整体动物研究。灵芝溶于生理盐水中于80℃水浴振荡2h后离心为水溶性部分（Part A）。在振荡后经三次快速冻融，然后离心，上清称为冻融部分（Part B），作试管内研究用。
D-氨基半乳糖（D-Galactosamine, Galn）由重庆医科大学制备。内毒素（Endotoxin,ET）O55B5由第二军医大学制备。I型胶原蛋白酶为Sigma产品。RPMI-1640培养基为GIBCO产品，含Hepes 15mM，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml及小牛血清10%。
D-氨基半乳糖与内毒素所致小鼠中毒模型
小鼠随机分为4组：第一组对照；第二组腹腔注射D-Galn 500mg/kg 30min 后再腹腔注射ET 100μg/鼠；第三组单独腹腔注射ET；第四组单独腹腔注射D-Galn。给毒剂后10h，分别取血，分离血清，测定血清谷丙转氨酶（GPT）及谷草转氨酶（GOT）活力。
灵芝对联合中毒小鼠肝脏的保护作用
小鼠随机分成三组：第一组腹腔注射D-Galn 500mg/kg及ET100μg/鼠作对照；第二、三组分别口服灵芝250或500mg/kg qd.×2。最后一次服用灵芝后1h，腹腔注射D-Galn及ET。给毒剂后10h，小鼠摘眼球取血、分离血清，测GPT及GOT。
血清中IL-1活性测定
上述各组小鼠血清以BALB/c小鼠的胸腺细胞生物检测其IL-1含量。选用BALB/c小鼠，分离胸腺，进而分离胸腺细胞，尼龙网过滤，离心，洗2次，计数，调至1×107/ml含Con A 2.5μg/m。取96孔培养板，每孔加入胸腺细胞0.1ml及稀释血清0.1ml，37℃ 5% CO2中培养72h。终止培养前6h，每孔加入3H-TdR 9.25kBq。培养结束后将细胞收集于纤维薄膜，β-液闪仪测cpm值。
大鼠离体肝细胞的制备及灵芝对CCl4中毒的保护作用
按Berry和Friend法分离大鼠肝细胞：大鼠于乙醚麻醉下门静脉插管，恒压灌流，流量9ml/min。开始时先灌流无Ca2+的生理溶液 A（96mM NaCl, 1.4mM KCl, 0.74mM MgSO4, 2.5mM KH2PO4,30mM NaHCO3及21.7mM葡萄糖酸钠），持续通入95% O2/5% CO2的混合气体，pH7.4, 恒温37℃。洗净肝脏内血液后，灌B液，含0.02%胶原蛋白酶，持续灌流8min。然后灌C液，含Ca2+及牛血清白蛋白1%，持续灌流4min。分离肝脏，置烧杯中，溶液含Ca2+及牛血清白蛋白，剪破肝脏包膜，释出肝细胞，于水浴中振荡数分钟，尼龙网过滤细胞，离心500rpm 1min。再洗2次。细胞于RPMI-1640溶液中计数，台盼蓝测活力应达90～92%，调节细胞浓度至5×106/ml。于24孔板中，每孔加入1ml。每组复管3孔。加入不同浓度灵芝（最终达0.01～10mg/ml）及20μl CCl4， 5% CO2 37℃培育1h，离心3000rpm,10min,分离上清，测定肝脏释放的乳酸脱氢酶（LDH）及GPT，以加入1% Triton X-100后肝脏细胞释放的酶活力为酶活力之总值[3]。
整体小鼠CCl4中毒及灵芝的保护
小鼠随机分成4组：A组对照，B组腹腔注射0.01% CCl4 0.18ml/10g, C及D组分别口服灵芝250或500mg/kg qd.×2。在第二次服药后1h腹腔注射上述量CCl4,24h后取血，分离血清，定量稀释，测GPT和GOT。
结 果
一、D-Galn合并ET致小鼠肝脏中毒
D-Galn 500mg/kg单独应用，只使小鼠SGPT轻度上升。ET 100μg/鼠并不引起明显的肝脏损害。当D-Galn与ET合用时，SGPT明显上升，P<0.01（表10-1）。
表10-1 D-氨基半乳糖和内毒素致毒小鼠的血清酶活性
Galn ET 鼠数 GPT GOT
组别 (mg/kg) (μg/只) （U/ml±SD） (U/ml±SD)
A -- -- 5 92±53 67±25
B 500 100 5 454±209** 106±16*
C 500 -- 5 157±88* 74±26*
D -- 100 4 59±17** 48±13*
B与A比较，C、D与B比较：*P<0.05, **P<0.01
二、灵芝对联合中毒小鼠肝脏的保护作用
表10-2表明给予口服灵芝250及500mg/kg均明显降低肝脏中毒小鼠的GPT活力，GOT亦有降低趋势。
表10-2 灵芝对联合致毒小鼠肝脏的保护作用
组 别 mg/kg Galn/ET 鼠数 GPT GOT
（U/ml±SD） (U/ml±SD)
灵芝 -- + 6 1474±548 238±101
灵芝 250 + 6 583±733* 127±44*
灵芝 500 + 6 310±182** 162±161
Galn: 500mg/kg; ET: 100μg/鼠； *P<0.05, **P<0.01
取出上述各组小鼠的血清研究灵芝对中毒小鼠血清中IL-1样物质活力的影响。发现小鼠于联合中毒后血清IL-1样物质水平明显低于对照组。灵芝可使降低的IL-1趋于升高，提示联合中毒小鼠免疫功能低下，灵芝对具有免疫调节作用的单核细胞因子的IL-1有一定的调节作用（表10-3）。
表10-3 灵芝对联合中毒小鼠IL-1样物质的影响
血清稀释
鼠数 1∶40 1∶20 1∶10
对照 5 16319±6261 5828±1241 627±158
Galn/ET 4 7240±4843 2876±2439 480±393
灵芝Galn/ET 5 11351±7384 3085±1746 308±88
三、灵芝对CCl4致离体大鼠肝细胞中毒的保护作用
表10-4结果表明，灵芝对CCl4中毒的原代培养肝细胞有一定保护作用。加入灵芝以后，肝细胞释放的LDH及GPT均明显降低。
表10-4 灵芝对CCl4中毒毒肝细胞的作用
CCl4 灵芝 LDH GPT
μl/孔 mg/ml X±SD 释放率（%） X±SD 释放率（%）
-- -- 6800±200 39.4 43±3 23.6
CCl4 20 -- 14483±525 84.0 145±5 79.7
Part A 20 0.01 10225±225 59.3 85±6 46.7
20 0.1 9667±289 56.0 86±6 47.5
20 1 9417±144 54.6 85±2 46.9
20 10 9983±475 57.9 51±5 28.0
Part B 20 0.01 7717±375 44.7 62±3 34.1
20 0.1 9667±289 56.0 88±4 48.1
20 1 8700±260 50.4 73±6 40.3
20 10 10900±450 63.2 48±3 26.4
四、灵芝对整体CCl4中毒小鼠的作用
表10-5结果表明灵芝能明显降低CCl4中毒小鼠的血清GPT活力。
表10-5 灵芝对CCl4致毒肝脏的保护作用
组别 mg/kg CCl4 n GPT GOT
(ml/10g) (U/ml±SD) (U/ml±SD)
对照 -- -- 9 52±7 164±96
CCl4 -- 0.18 9 1015±0 426±756
灵芝 250 0.18 10 883±235 2192±1366
灵芝 500 0.18 10 712±396 1660±930
讨 论
早在1000多年前，中国古代医药学者已经注意到灵芝对肝脏的作用，故有灵芝“补肝气”之说。当然在《本草》中所指的“肝脏”具有更广泛的含义，其所指灵芝具有补肝气作用的确切含义亦待研究。
本研究重点是灵芝对肝脏受损病理模型的影响。
GPT和GOT均为反映肝细胞变性坏死的酶类，当肝细胞因中毒等发生变性坏死时酶类会释放出来，使血清中该类酶水平升高。由于GOT尚分布于心脏、肾脏与骨骼肌，而GPT则主要分布于肝脏，故血清GPT水平反映肝脏受损较GOT更特异，更敏感，在临床急性肝炎时持续升高时间也最长。灵芝能明显降低两种整体病理模型及中毒离体肝细胞释放的GPT，表明灵芝有一定的护肝作用。
乳酸脱氢酶广泛分布于体内各组织，催化乳酸转变为丙酮酸。肝炎的发病早期血清中该酶升高，亦反映肝细胞的受损。本文原代培养的大鼠肝细胞在CCl4中毒时LDH释放显著升高，灵芝能使之降低，亦提示灵芝的护肝作用。
IL-1是一种重要的单核细胞因子，有广泛的生物学活性，参与主要的免疫反应过程，其重要作用之一是刺激T细胞产生IL-2，既能调节免疫应答的水平，又有效应作用。在肝脏中毒时有关血清IL-1的水平未见报道，本研究用D-Galn和内毒素造成肝脏中毒，结果发现这种联合中毒致肝损伤的小鼠，血清中IL-1水平较正常动物的水平为低，提示肝脏中毒时机体的免疫功能下降。服用灵芝后IL-1水平有上升趋势，这与本室其他研究结果相符，说明灵芝具有一定的免疫调节作用。 |
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