| 灵芝对抗体形成细胞和变态反应的影响 |
| 【 整理发布：王力野生灵芝网 】 【 发布日期：7/6/2011 】 浏览次数:1441 |
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提要 本文观察灵芝对抗体形成细胞，大鼠被动皮肤过敏反应，绵羊红细胞引致迟发型过敏反应，2，4-二硝基氯苯引起的接触性皮炎及Arthus反应的影响。研究发现灵芝无论在试管内或整体均抑制抗体形成细胞的数目，明显抑制迟发型过敏反应及接触性皮炎和Arthus反应。但对大鼠的被动皮肤过敏反应，仅有抑制趋势。
关键词 灵芝；迟发型过敏反应；被动皮肤过敏反应；接触性皮炎；Arthus反应
灵芝在民间作为药用已有相当悠久的历史。在“本草纲目”中，灵芝列为上品，属珍贵药物。一般认为其具有保健作用，但对免疫功能的作用研究尚不多，作用机理亦不甚了解。本文主要观察在日本增植的灵芝对抗体形成细胞及变态反应的影响。
材 料 与 方 法
动物
昆明种小鼠，20～25g; Wistar大鼠，♂，150～200g，家免，2kg，均由上海医科大学实验动物部供应。
试剂
灵芝热水浸出物由日本和汉生药研究所提供。作整体研究所用灵芝，以0.2%羧甲基纤维素钠配制。试管内研究所用灵芝溶于生理盐水中，制备方法同前（本论文集第1页）。置80℃水浴振荡2h然后离心，上清液置于-4℃，直至使用，此为水溶部分。冻融部分制备也如前。
美洲商陆（PWM）、脂多糖（Lps）均为Sigma产品。RPMI-1640为GIBCO产品，含15mH Hepes，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素及10%小牛血清。
试管内研究溶血空斑形成细胞 （PFC）
小鼠颈椎脱位致死，取脾，脾细胞以RPMI-1640洗2次后，计数，于24孔培养板中每孔加入1ml含5×106个脾细胞，加入绵羊血红细胞（SRBC），有的孔加入被测样品，每组复孔3个，于37℃ 5% CO2中培养96h。培养结束时，收集细胞，洗2次，调至所需细胞浓度。以100μl脾细胞，100μl补体，50μl SRBC与0.25ml 0.4%琼脂糖混合，由此取出100μl制片。全部玻片在37℃中培养3h，于倒置显微镜下检测溶血空斑数。以t测验进行统计分析。
整体研究溶血空斑形成细胞（PFC）
小鼠于d0腹腔注射2% SRBC 0.5ml鼠致敏。随机分为3组，对照组与灵芝1、2组。对照组口服CMC，灵芝组分别口服125及500mg/kg qd.×4(d0～d３)，于ｄ4处死小鼠,测定各组小鼠脾脏之PFC数。
大鼠被动皮肤过敏反应（PCA）
40只大鼠，随机分成4组。对照组口服（组1）0.2% CMC，灵芝组（组2，组3）分别口服灵芝125及500mg/kg qd.×5(-d2～d2)，组4静脉给色甘酸钠。于d0全部大鼠皮内注射IgE样抗体（即抗天花粉蛋白抗血清，以括楼部分离所得天花粉蛋白为抗原）。当大鼠背部以不同稀释度IgE样抗血清被动致敏后48h，也即各组大鼠末次服药后2h，色甘酸钠组静脉注射10mg/kg后，立即静脉注射内含抗原10mg/kg的1%伊文氏蓝溶液进行攻击，30min后处死大鼠，测定背部皮肤蓝染的程度。除测量蓝染皮肤的直径外，再剪下蓝染部位，剪碎，置于定量NS∶丙酮=3∶7的溶液中，放置48h，离心，于620nm测光密度进行比较。
迟发型变态反应（DTH）
每只小鼠于d0以10% SRBC 0.5ml/鼠腹腔注射致敏、灵芝组口服灵芝qd.×8(d0～d7)，于ｄ7在小鼠左足掌注射50μl 10% SRBC，左足掌注射等量NS，24h后测量左右足掌之体积差，以下式计算结果。
Δ=V=VL-VR
DNCB 引起的接触性皮炎
以2，4-二硝氯苯（DNCB）作为刺激剂。小鼠剃去背部与腹部的毛，在d1及d2以20μl 50%的DNCB均匀涂在小鼠背部无毛区。对照组口服0.2% CMC qd.×16，灵芝组分别口服250及500mg/kg，qd.×16,地塞米松组腹腔注射10 mg/kg，qd.×3及q2d.×7。在d14以4% DNCB丙酮溶液20μl涂于腹部无毛区1×1cm的部位进行攻击。32h以后，又以30μl 10% DNCB甘油溶液涂于左耳。30min后，静注0.5% Evan’s蓝溶液(0.1ml/10g)。再经30min，小鼠颈椎脱位处死，以打洞器取下双侧耳朵，测重量差。并比较腹部皮肤蓝染程度。
Arthus反应
家兔Arthus反应是Ⅲ型变态反应的代表性病理模型，由IgG与IgM介导。每ml完全福氏佐剂中含卵蛋白10mg。每只家兔肌肉注射1mL，每周一次，共4次。最后一次注射卵蛋白后第9天背部剪毛。第10天在抗原攻击前给药。对照组静注NS，灵芝组分别静注0.5及1.0g/kg，地塞米松组静注5mg/kg，1h后进行抗原攻击，即在背部皮内注射1%卵蛋白0.2ml/点,共4点。观察抗原攻击后不同时间局部红肿的直径与程度，分级记录。
（++++）明显出血，呈融合状，并有坏死灶。
（+++）明显充血，出血呈融合状。
（++）中度充血，出血呈斑块状。
（+）轻度充血出血。
（-）无反应。
结 果
一、 灵芝在试管内对PFC的影响
实验结果证明灵芝的水溶部分（Part A）及冻融部分（Part B）10～1000μg/ml都明显抑制试管内ＰＦＣ的形成（表２－１）。该作用与灵芝的浓度呈正相关。
表２－１ 灵芝在试管内对ＰＦＣ的影响
剂量 ＰＦＣ／１０8细胞 抑制率
组别 μｇ／ｍｌ X±SD %
对照 -- 1890±164
A灵芝 10 1484±247 21.5*
灵芝 100 1203±312 36.4**
灵芝 1000 281±62 85.1**
B灵芝 10 938±265 50.4**
灵芝 100 1234±416 34.7*
灵芝 1000 266±94 86.0**
A:水溶部分LZ B:冻融部分LZ 对照:NS
X±SD:*P<0.05, **P<0.01
二、 灵芝对整体PFC的影响
灵芝口服125，500mg/kg，qd.×5明显抑制小鼠脾脏内PFC数(表2-2)。
表2-2 灵芝对整体PFC的影响
剂量 ＰＦＣ／１０8细胞 抑制率
组别 mg/kg X±SD %
对照组 -- 70400±7200
灵芝 125 41000±3250 41.8**
灵芝 500 26400±1720 62.5**
注:若d0腹腔注射羊红细胞，则灌胃给药期为d0～d4
对照组：0.2% CMC
X±SD; **P<0.01
三、 灵芝对大鼠PCA试验的影响
研究结果表明色甘酸钠静注10mg/kg明显抑制大鼠PCA反应。灵芝口服125，500mg/kg qd.×5，对PCA反应只有轻度抑制趋势，无显著统计学差异
四、 灵芝对迟发型变态反应的影响
结果证明口服灵芝500mg/kg明显抑制由SRBC引起的DTH反应，环磷酰胺10mg/kg腹腔注射qd.×8亦有明显抑制作用.
五、 灵芝对DNCB引起接触性皮炎的作用
结果证明灵芝对于DNCB引起的接触性皮炎有明显抑制作用,口服250或500mg/kg qd.×16均有效。地塞米松10mg/kg亦有效（表2-3）。
表2-3 灵芝对接触性皮炎的影响
剂量 动物数 耳增重% 皮肤
药 物 mg/kg 蓝染程度
对照组 -- 10 12.6%±9.7% 卅
地塞米松 10 10 2.5%±4.1%** ±
灵芝 250 9 3.7%±4.1%* 卄
灵芝 500 9 2.3%±3.1%** 卄
对照组:0.2% CMC, p.o. qd.×16
地塞米松:腹腔注射qd.×3→q0d.×7
灵芝:口服,qd.×16
耳增重%=△W/WR×100%·△W=W左-W右
*P<0.05, **P<0.01
六、灵芝对Arthus反应的影响
结果见表2-4，2-5。对照组在抗原攻击后2h开始已有充血出血，4～８ｈ融合成片状出血，12h有坏死灶。地塞米松组在抗原攻击后2h尚无反应，4h开始有轻微反应，6h以后有中度充血出血。灵芝0.5及1.0g/kg组，在抗原攻击后2～8h的反应明显比对照组为轻，但8h以后与对照组比较已无明显差别。
表2-4 灵芝对Arthus反应的影响
剂量 抗原攻击距 抗原攻击后的炎症反应（cm）
药物 给药时间
（mg/kg） （min） 2h 4h 6h 8h 12h 24h
对照 -- 60 +++ +++ +++ +++ ++++ ++++
地塞米松 5 60 -- ± ++ +++ +++ +++
灵芝 500 60 ± + ++ +++ ++++ ++++
灵芝 1000 60 + ++ ++ +++ +++ ++++
表2-5 灵芝对Arthus反应的影响
剂量 抗原攻击距 抗原攻击后的炎症反应（cm）
药物 给药时间
（mg/kg） （min） 2h 4h 6h 8h 12h
对照 -- 60 1.52±0.94 2.54±0.66 2.73±0.65 3.40±0.87 3.43±0.52
地塞米松 5 60 0 0.55±0.50 2.29±0.23 2.71±0.55 3.01±0.53
灵芝 500 60 0.45±0.48 1.74±0.66 2.38±0.35 2.72±0.15 2.82±0.10
灵芝 1000 60 0.27±0.07 1.54±1.05 1.84±0.21 2.82±0.49 2.89±0.46
讨 论
日本灵芝的热水提取物毒性很小。本实验室在以往工作基础上（1，2），以及参照有关实验（3）研究证明小鼠口服该提取物5g/kg，观察一周，无鼠死亡。本草纲目曾记载灵芝无毒，可以长期服用。
本文研究表明灵芝在试管内（10～1000μg/ml）及在整体500mg/kg均可抑制抗体形成细胞的数目。通过淋巴细胞增殖的研究证明灵芝有免疫调节作用，当机体在免疫功能低下时灵芝有上调作用。本文进一步证明，当机体在过敏状态时，免疫功能过强时，灵芝有下调的作用。本研究证明口服灵芝500mg/kg能抑制迟发型过敏反应。由此证明灵芝对于Ⅰ，Ⅱ及Ⅳ型变态反应均有抑制作用，进一步证明灵芝具有免疫调节作用。 |
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