| 灵芝对超氧阴离子自由基的作用 |
| 【 整理发布：王力野生灵芝网 】 【 发布日期：7/6/2011 】 浏览次数:1715 |
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提要 本文用黄嘌呤——黄嘌呤氧化酶——鲁米诺化学发光检查法以及电子顺磁共振（ESR）法，测量灵芝清除超氧阴离子自由基（O-2）的能力。实验结果表明，灵芝在鲁米诺化学发光法检测中，有剂量依赖性的清除O-2的作用，其抑制发光强度50%（LC50）的剂量，灵芝制剂A为48.5μg/ml，制剂B为30.4μg/ml。电子顺磁共振ESR法的结果表明，灵芝制剂A和B（0.25μg/ml）分别使ESR信号强度降低84%和86%左右。以上结果说明灵芝能清除O+2，具有抗氧化剂作用。
关键词 灵芝；自由基；超氧阴离子自由基；鲁米诺化学发光体系；电子顺磁共振
临床资料表明，灵芝能防治衰老和心血管疾病，并具有抗癌、抗炎的作用。已经了解，在上述疾病的病理过程中，均有自由基的参与。本文旨在阐明灵芝对超氧阴离子自由基（O-2）的作用。在生物学领域中，电子顺磁共振（ESR）检测法和鲁米诺化学发光法（CL体系）是当前常用的研究自由基的方法。为互相验证，本研究同时应用以上两种方法检测灵芝对O-2的作用。
材料和方法
试剂
黄嘌呤和鲁米诺购自Sigma公司。黄嘌呤氧化酶根据文献提取。K，O-2为Alfa公司产品。二甲基亚砚（DMSO）购自南新溶剂厂。
灵芝干浸膏粉由日本和汉生药研究所提供。粉末加蒸馏水配成0.25g/ml，在80℃水浴中振摇4h，离心30000g，15min取上清，为制剂A。粉末配成0.25g/ml，在80℃水浴中振摇4h,置-30℃ 1h，取出，置37℃中融解。如此反复冻融三次，离心30000g，15min，取上清，为制剂B。制剂A1 B1即以蒸馏水分别稀释A或B各20倍。
仪器
SHG—1型鲁米诺化学发光测量仪。Varian E-112电子顺磁共振波谱仪，X波段，调制频率100kHz，调制幅度2×1G， 增益5×104，微波功率200mW，时间常数0.25s，液氮温度77K下测量。
鲁米诺化学发光体系
在1.2×5cm的试管中，加入50μl鲁米诺，100μl灵芝，800μl黄嘌呤液，上机测本底后，加50μl黄嘌呤氧化酶混匀，启动发光反应，记录光发射10s。灵芝的LC50根据文献统计。
电子顺磁共振检测
在顺磁样品测试管中，加入含K，O-2100mmol/L的DMSO 400μl，再加100μl DMSO（作为对照）或灵芝制剂100μl，总容量为500μl，在液氮温度77K下测量。
结 果
一、灵芝对鲁米诺发光体系的作用
图16-1示发光反应的动力学变化。结果表明，加启动剂后10s发光的反应最强，以后逐渐减弱。本实验在鲁米诺发光体系中，加入5～100μg/ml灵芝制剂，测量10s的发光强度。结果表明，灵芝制剂A和制剂B都具有浓度依赖性的清除O-2的能力，其抑制发光强度50%（LC50）的浓度分别为48.5μg/ml和30.4μg/ml（表16-1，2）。
表16-1 灵芝A制剂对化学发光的抑制作用（n=3）
灵芝 发光强度均值 发光强度 发光强度抑制
μg/ml GP10s % %
0 49803 100.0 0
100 11340 22.8 77.2
80 12067 24.2 75.8
50 24669 49.5 50.5
40 28403 57.0 43.0
25 38528 77.4 22.6
表16-2 灵芝B制剂对化学发光的抑制作用（n=3）
灵芝 发光强度均值 发光强度 发光强度抑制
μg/ml CP10s % %
0 53114 100.0 0
80 9799 18.4 81.6
40 22093 41.6 58.4
30 27230 51.3 48.7
20 29431 55.4 44.6
10 40092 75.5 24.5
5 44078 83.0 17.0
二、灵芝对电子顺磁共振波谱的作用
在液氮温度下，测定O-2自由基g=2.0094, g=2.0020，灵芝制剂A和B对O-2均有明显歧化作用。加入制剂A使O-2的g1峰高从24.1cm降至4cm，制剂B使之降为3.4cm，当制剂A和B各稀释20倍（制剂A1和B1）时对O-2仍有歧化作用，但能力随之降低，A1使峰高降至20.5cm,B1使峰高降至11.9cm。
讨 论
自由基是指带不配对电子的原子、离子和分子。已知存在于细胞中的氧多数是通过细胞色素氧化酶生成水而消耗的，然而部分分子氧在代谢中能接受单个电子生成超氧阴离子自由基：
O2+e→O-2
一旦生成O-2，将进一步还原成H2O2以及活性很强的羟基自由基OH，造成氧自由基对细胞的损害。例如，氧自由基可使酶失活，DNA断裂，蛋白交联和脂质过氧化。此外，目前还提出自由基是衰老的原因。
动、植物机体本身存在保护机制即抗氧化保护机制，能限制自由基造成的损害。灵芝是传统的著名中草药，对与自由基有关的某些疾病又有疗效。为此研究灵芝浸出液清除超氧阴离子自由基的作用，是很有意义的。
本文应用的黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶反应是一种常用的超氧化合物发生系统。用黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶——鲁米诺化学发光法检测的结果表明，灵芝对其具有剂量依赖性的抑制能力。灵芝制剂A和B的抑制发光强度LC50的浓度分别是48.5μg/ml和30.4μg/ml。由于黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶反应亦可为黄嘌呤氧化酶抑制剂所抑制，考虑到这种可能性，故同时应用另一种方法验证灵芝清除O-2的能力。
ESR技术能直接检测自由基，为此观察了灵芝对O-2的ESR波谱的影响。结果表明，灵芝能减弱ESR信号的强度，其抑制作用呈浓度相关性。
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